澳门六合彩现场开奖 细胞骨架的结构和机械重塑保管急性动态拉伸下三维微组织的张力稳态
当拉伸时，在2D基底上培养的细胞分享浩荡的软化和流化反应，这是由于对保守的细胞骨架元件的重塑知之甚少。但是，无人不晓，细胞骨架的结构和分散受到细胞环境维度的潜入影响。因此，在这项研究中，咱们的主张是细目在3D基质中培养的细胞是否具有这种软化活动，并将其与细胞骨架重塑谈论起来。为了竣事这一盘算推算，咱们开拓了一种高通量的轨范来测量细胞的动态力学特点，并允许在生理关系的3D微组织内进行亚细胞成像。咱们发现，成纤维细胞，平滑肌和骨骼肌微组织应变软化，但不变形，并在加载住手后，他们规复其运行的机械性能。此外，微组织预应力跟着应变幅值的减小而减小，以保抓恒定的平均张力。 这种适应下的养分条目下导致延迟。一个丝状的肌动卵白细胞骨架是必需的，并反馈了反应的变化，肌动卵白重塑率和拉伸领导的肌动卵白解聚的视觉字据。咱们用于评估细胞力学的新轨范将2D培养物中不雅察到的活动与3D基质谈论起来，并将细胞骨架的重塑与组织的稳态机械退换谈论起来。
Introduction 先容伸开剩余96%跟着每一次呼吸，心跳和通顺，咱们身体中的细胞履历周期性的机械拉伸，这反过来又在粘着灶处产生抓续不通晓的力，穿过细胞膜，沿着细胞骨架丝并穿过细胞核1，2。在细胞中，这些力通过产生构象变化来率领功能和表型活动，从而篡改配体-受体亲和力1，2。遑急的是，细胞感受和适应机械力的能力与正常发育和功能以及疾病进展（包括骨骼、肌肉、腹黑和肺部疾病以及癌症）中的枢纽事件联系3，4。
超过是，构成真核细胞细胞骨架的保守结构元件自身是机械敏锐的;响应动态拉伸，细胞骨架软化（弹性镌汰），变得更像流体（加多相位滞后/弹性）5，6，7，8。然后，在伸展住手时，它会徐徐规复僵硬并重新凝固7。由于这种反应背后的分子机制（S）仍然不了了，量化细胞骨架重塑后，周期性拉伸的视觉字据短长常遑急的，咱们的限度9，10，11，12，13。 此外，尽管在亚细胞水平5、6和单细胞水平7、8不雅察到响应于变形的软化和流化，但是在组织水平14、15、16对响应的进度仍然知之甚少。但是，在身体中，该响应与气谈口径14、15的保管和血压17的退换关系联。但是，由于未知的原因，它在某些病感性疾病中不存在。举例，与健康的肺不同，深吸气的伸展不会膨大哮喘息谈18。
咱们面前对这种应变软化活动的贯串主要来自于对离体组织样品和分离细胞的研究。诚然研究好意思满的体外样品的机械活动还是进一步加深了咱们对拉伸的组织水平响应的意志14、15、16、19，但是这种轨范对于发扬亚细胞重塑具有较差的分辨率。离体组织的使用可能进一步受到供体间变异性和样品可用性低的拆开。另一方面，亚细胞细胞骨架重塑反应和机械转导路线在很猛进度上是通过在刚性平坦名义上孤单助长细胞而发现的。但是，无人不晓，细胞助长的物理环境会篡改其机械特点和活动。 举例，助长在刚性基底上的细胞倾向于使其肌动卵白细胞骨架陈设成讲求的应力纤维，而且当与较软基底20、21、22上的细胞比拟时更刚性、更像固体而且处于更大的预应力下。
除了基质硬度，东谈主们怀疑细胞的力学活动可能会进一步篡改其环境的维度。为了支抓这一络续增长的假定，在2D基质上培养细胞与在生理学上更关系的3D基质内培养细胞比拟，通过迫使粘附复合物的非自然顶部-底部极性，从根柢上篡改了细胞骨架的分散和结构23。刚性，平坦，培养皿和软3D细胞外基质（ECM）之间的各异也不错解释不雅察到的细胞活动各异，以及使用老例2D细胞培养期间开拓药物妥协时时常发生的力图临床试验中的疗效赔本24，25，26，27。 因此，需要新的高通量细胞培养期间，其概况在细胞和亚细胞水平上探伤机械活动，同期保抓生理学关系的软3D环境。
为了兴盛这一需求，允许评估重建的3D胶原凝胶内细胞的机械活动的期间一直是机械生物学、药理学和组织工程限度的浓厚兴味28。超过是对于它们对拉伸的响应，已知3D培养物内的细胞通过在相背方朝上篡改它们的收缩性来响应基质张力的准静态变化，以便在通盘细胞培养物中保抓张力稳态29、30。在其他出书物中，步长变化后的这些活动与肌动卵白解聚和随后的强化反应联系31，32。 但是，仍然不了了3D培养物是否在好意思满的离体组织样品和分离的细胞的轮回拉伸下具有相通的机械和细胞骨架重塑响应14、15。也便是说，在3D培养物的动态拉伸期间，还是通晓随后的加载轮回的峰值力朝向平台33减小，这标明适应性应变软化活动。但是，咱们的限度缺少一个好意思满的表征，这种机械响应和细胞骨架重塑动态拉伸在3D细胞培养。
尽管3D细胞培养在生理学上更关系，第三维可能会显贵篡改咱们对细胞力学的贯串，但2D培养仍然是咱们限度的主导期间。在其原因中，在先前的研究34、35、36中使用的内容凝胶的厘米轨范限制了实验通量，导致成像清贫，产生育分物的高扩散障蔽，而且可能减缓对可溶性因子的动态响应。但是，批量3D细胞培养的这些局限性在很猛进度上不错通过遴荐芯片实验室轨范缩小细胞培养尺寸来克服。在这方面，Legant et al. s37.微制造的组织计量器（微组织）允许对细胞收缩期间的快速能源学和力产生进行相对高通量的评估37。 在他们的模子中，细胞在胶原卵白基质中，并在成对的柔性垂直杠杆周围造成一系列讲求的、有组织的结构，与离体组织十分。高通量张力测量不错从杠杆的可见偏转计较出来。最近，研究东谈主员将磁性微球固定在每个微组织孔中的一个杠杆上，并使用磁性镊子一次拉伸一个微组织以进行准静态刚度测量38，39。磁驱动安装的实验通量和致动规模的限制最近由咱们的微组织微致动拉伸器（MVAS）40处置。在这项责任中，由于大部分平面变形和慢性（几天）退换后，MVAS不错高通量可视化拉伸期间的细胞重塑。
咱们当今冷漠了一种新的微组织拉伸器，MVAS力，它不错测量张力和动态力学分析。与咱们畴昔的设想相背，MVAS-力中唯惟一个悬臂通过退换真空压力驱动，而同期从另一个悬臂的被迫症结测量力。在这篇著作中，这种新的轨范使咱们概况评估动态加载历程中庸加载住手后的微组织的机械性能，并相接到亚细胞重塑力学的变化，使用响应药物妥协和径直成像的细胞骨架。从咱们对细胞感知机械力的能力或受损能力的轨范中不错获取的发现可能对于了解体内发育，正常功能和疾病进展的路线至关遑急。
Results 成果Microtissue morphology 微组织形态学在MVAS-Force中，3 T3成纤维细胞围绕杠杆自拼装成讲求、高度组织化的三维结构，在形态上肖似于组织。完全压实的代表性微组织的俯瞰图和横截面图如图1c所示。如先前37、40、41所示，细胞将胶原基质从孔的底部和侧面压缩成开脱悬浮在悬臂顶部周围的组织。4天后在其中心测量的平均微组织厚度为97 ± 2 μm（n = 5），而且沿纵轴沿着定性均匀。
MVAS-Force可对3D细胞培养物进行高通量动态力学测量。MVAS-力由三个微制造器（a）微制造。它包括微组织威尔斯阵列，每个微组织由可控真空室（B）界定。（c）中通晓了微组织的自顶向下和横截面视图。微组织是讲求的、有组织的、三维的细胞培养物，它们开脱地悬浮在细胞杠杆周围。共焦叠层、正交视图和高放大率图像的最大投影示于（d）中。肌动卵白细胞骨架为绿色，细胞核为蓝色。细胞骨架和细胞核都通晓出高度的组织化，在细胞杠杆之间陈设。B、c和d中的比例尺隔离暗示1 mm、100 μm和50 μm。
图1d通晓了一个典型的微组织在四天内的正交切片和中央位置的F-肌动卵白和细胞核的放大视图的最大强度投影。肌动卵白高度团员成讲求的应力纤维，这些应力纤维与微组织的纵向轴线取向。细胞核也大多与微组织对都，而且在三维中均匀分散。
Microtissues strain soften to maintain their mean tension微组织应变软化以保抓其平均张力据平素报谈，急性动态拉伸篡改了二维名义上助长的细胞的机械性能;它们变得更柔滑（弹性镌汰）和更像流体（相位滞后加多）7，11，42。在这方面，咱们脱手研究是否由3 T3成纤维细胞构成的3D微组织分享这些活动，通过评估它们在0.25 Hz下逐步增大的应变下的动态力学性能。
如所预期的，微组织储存刚度（k '）以应变依赖性花样镌汰（N = 22，线性归来：R2= 0.97，p < 0.001）（图2a）。比较9%至1%应变，平均储存刚度镌汰26 ± 2%（重复测量t考试：p < 0.001）。但是，与先前发表的对于2D培养物7和好意思满气谈肌肉组织条14、15中的细胞的发现不同，其中软化伴跟着更肖似流体的活动（或流化），微组织的相位滞后（δ）反而跟着应变幅度而镌汰（线性归来：R2= 0.95，p < 0.01）（图2b），标明在较高水平的应变下，对于给定量花消的更大量的能量储存。 因此，与分离的细胞7和离体组织条14、15比拟，成纤维细胞微组织跟着它们软化而变得更像弹性。
3 T3成纤维细胞微组织应变软化以保抓恒定的平均应力。跟着飘荡应变幅的增大（N = 22），储存刚度k '（a）、应力-应变相位滞后δ（B）和预应力T0（c）均减小。遑急的是，尽管平均微组织长度L avg（d）线性加多，但刚度和预应力的镌汰导致平均应力Tavg（c）恒定。在养分助长条目下，这些活动加多了偏移微组织长度L。为了不雅察这些反应是否可逆，微组织在大幅度应变下飘荡，直到随后的加载轮回相通（1），然后霎时切换到小幅度应变（2）（e）。 存储刚度（f）和预应力（g）在160秒内以相似的速度完全规复到其运行值（N = 8）。在该图中，预应力和平均应力暗示为与最小应变幅的差。
微组织中的软化反应还伴跟着其预应力（To）的镌汰（线性归来：R2= 0.97，p < 0.001）（图2c）。比较9%应变与1%应变，平均预应力镌汰2.7 ± 0.3 μN（N = 22，重复测量t考试：p < 0.001）。遑急的是，与软化响应一谈，预应力的这种镌汰导致平均张力相对于应变幅度不变（线性归来：p > 0.5）（图2c）。尽管平均微组织长度（Lavg）线性加多（线性归来：R2= 0.99，p < 0.001），但仍发生了这种活动（图2d），而且标明细胞和组织具有内在的张力稳态响应29，30。
此外，由于咱们斟酌了养分助长条目，因此在加载轮回期间的最小微组织长度（L。偏移长度）随拉伸幅度加多（线性归来：R2= 0.99，p < 0.001）（图2d）。因此，与先前对于离体组织条15、19的报谈一致，微组织在动态拉伸下的张力退换能力导致其延迟。
上述应变软化响应在复返到小振幅飘荡时是完全可逆的（图2e）。刚度和预应力规复隔离如图2f、g所示（N = 8）。160秒后，微组织刚度规复到其运行值的99 ± 3%，而且预应力与运行测量值吻合邃密（两次重复测量t考试：P > 0.05）。刚度和预应力的规复弧线撤职拉伸指数函数（等式10）。1）具有一致的时刻（τ）（38 ± 1对35 ± 6秒）和幂律常数（β）（0.87 ± 0.01对0.92 ± 0.08）（SI 1）。此外，偏移的微组织长度也以相通的能源学规复（数据未示出）。
为了细目在轮回加载历程中微组织内的软化活动如何发展，在图3中查验了从静态脱手的第一双退换轮回。在0.25 Hz的加载频率下，微组织的机械活动在这些运行加载轮回中适应（图3a）。在这方面，预应力朝着新的设定值下跌（图3c），而平均张力速即加多，然后通晓回到静息张力（图3d）。当咱们斟酌到一个助长张力负荷时，这些变化导致了渐进的组织延迟（图3e）。相背，当加载时刻（400秒）比规复时刻常数（1/fτ）慢得多时，机械适应的进度镌汰，而且主要发生在第一个加载轮回中（图3b-e）。 此外，当以这种安稳的速度围绕偏移应变飘荡时，平均张力并不通晓于其静息张力（图3d）。因此，唯独当动态加载速度快于张力规复速度时，张力稳态才会发生。
对飘荡负载的适应取决于负载频率。在0.25 Hz和0.0025 Hz下，从静止脱手的平均（N = 6）退换轮回隔离如（a，B）所示。在这两种情况下，预应力跟着随后的加载轮回朝向新的设定点而减小，但跟着加载频率的加多而减小的进度更大（c）。诚然当安稳施加飘荡时平均张力保抓升高，但跟着迥殊的轮回，平均张力在0.25 Hz（d）下朝向静息张力镌汰。在助长张力条目下，当飘荡频率快于规复时刻常数（1/fτ）时，这些活动导致渐进性延迟反应（e）。但是，当飘荡频率慢于规复时刻常数（1/fτ）时，不存在这种延迟响应。
在本节中，咱们还是标明，与2D培养中的细胞一样，3D微组织培养物应变软化以稳态保管其平均张力。肌动卵白丝7、9、10、11通过切丝卵白13的割断能力解聚和肌球卵白马达集聚14、15、43、44、45的扰动是先前假定的2D培养中细胞中这种反应的机制。另一方面，微管的参与在很猛进度上被忽视，尽管它们对通盘细胞力学46，47，48，49和它们的动态不通晓性50的孝顺。因此，咱们研究了肌动卵白，肌球卵白和微管对微组织应变软化的孝顺。 咱们脱手研究肌动卵白微丝的参与。
Dynamic stretch remodels and depolymerizes actin动态拉伸重塑息争聚肌动卵白为了评估肌动卵白细胞骨架在应变软化中的作用，用细胞松懈素D（CytoD）解聚f-肌动卵白。如所预期的，CytoD处理镌汰了静息张力、僵硬度和相位滞后（图4a和S12）。遑急的是，CytoD处理还收缩了软化反应（N = 16次重复测量t考试，p < 0.001）（图4 b）。事实上，CytoD处理的微组织的刚度与应变幅度无关（重复测量t考试，P > 0.05）。拉伸住手后，CytoD处理也壅塞了张力规复;进一步讲授CytoD处理的微组织不会软化（图4c）。这些成果标明，应变软化是依赖于一个密集团员的肌动卵白细胞骨架的变化。
软化需要好意思满的肌动卵白细胞骨架。CytoD妥协前后的微组织图像见图（a）。如红色虚线和黄色虚线椭圆所示，它们刻画了力传感悬臂的顶部（左），F-肌动卵白与细胞松懈素D（CytoD）的解聚作用显著地使悬臂向外迁移，标明静息张力较低。遑急的是，CytoD处理镌汰了大幅度拉伸与小幅度拉伸下的刚度变化（即，应变软化量）（B）。在牵张住手后也莫得张力规复（c）。（a）中的比例尺暗示100 μm。
上述成果标明，f-肌动卵白是微组织应变软化所必需的。为了进一步将软化反应与细胞骨架的变化谈论起来，咱们用活细胞染色剂标志了肌动卵白丝。然后，通过比较不同抓续时刻的静态休息或飘荡拉伸之前和之后拍摄的图像，咱们评估了拉伸是否加多了肌动卵白重塑的速度。关系所有这个词热图通晓了微组织中心区域内的肌动卵白重塑（关系所有这个词低的区域暗示高重塑），如图5a所示。肌动卵白重塑是空间异质性的通盘微组织，并跟着时刻的推移，静态和负载条目下加多。遑急的是，与静态条目比拟，飘荡负荷在1分钟和5分钟后显贵加多肌动卵白丝的重塑（镌汰平均关系所有这个词）（N = 6，重复测量t考试，P < 0. 05）。05)（图5b）。
飘荡拉伸加多3D培养中活细胞中肌动卵白丝的重塑。通度日细胞染色和比较不同抓续时刻拉伸或静态培养前后即刻集聚的共聚焦堆栈，在活微组织的中心区域（212 × 106 µm;红色矩形）测量飘荡拉伸对肌动卵白重塑速度的影响（a）。彼此关所有这个词的代表性热图通晓肌动卵白重塑在空间上是不均匀的，而且跟着大幅度拉伸而加多，相对于静态条目（B）。平均关系所有这个词显贵镌汰（即。在1分钟和5分钟后（B），当拉伸相对于静态时，发生了更大量的重塑）。（B）中的比例尺暗示50 μm。（*P < 0.05; N = 6重复测量t考试）。
为了研究重塑是否只是由组织变化或细丝解聚引起，在9%应变下拉伸不同抓续时刻后立即固定微组织并染色。代表性图像、平均热图和每个细胞的平均f-肌动卵白抒发（隔离为图6a-c）都标明f-肌动卵白在飘荡拉伸下快速解聚（N > 14）。但是，这种响应的进度（25%减少）显著小于先前在2D培养物中的分离细胞中的报谈（约50%减少），其在可比较的全体应变幅度下12、13，这可能是因为由更软的ECM40内的细胞旋转引起的应变屏蔽。
参考中超联赛，球员对裁判动手被罚禁赛一年，外界一致认为CBA联盟这次绝对不会轻饶赵睿。可没成想北京时间1月2日，CBA正式官宣了对赵睿的处罚，仅仅只是禁赛五场，罚款十万，与此前外界传言的禁赛一年罚款百万简直是天壤之别。值得一提的是，赵睿被罚的同时，球队主帅刘炜也被判连带责任，罚款两万。
F-肌动卵白跟着拉伸解聚，并在拉伸住手时重新团员。不同拉伸抓续时刻后的代表性图像通晓，拉伸抓续时刻越长，肌动卵白丝越少（a）。平均热图中的F-肌动卵白抒发跟着拉伸抓续时刻肖似地镌汰（B）（N > 14）。此外，f-肌动卵白抒发在牵张住手后规复到运行值（N > 11）。在不同的拉伸和规复抓续时当前，归一化为细胞数目的平均肌动卵白抒发隔离通晓在（c，d）中。（a，B）中的比例尺隔离代表50和100 μm。
然后，为了通晓f-肌动卵白在拉伸住手后重新团员，将微组织固定并在拉伸5分钟后的不同规复时刻后染色。平均热图和每个细胞的f-肌动卵白抒发（图6 b、d）通晓完全规复到运行抒发值（t考试P > 0.05）（N > 11）。诚然咱们的f-肌动卵白抒发的时刻分辨率很差，不细目性很大，但f-肌动卵白规复的速度似乎与张力和刚度规复的速度在归并数目级（数十秒）内，这标明机械测量反馈了肌动卵白的再团员。此外，3D微组织中肌动卵白的回收率与先前在分离细胞12、13和大量3D培养物31中的报谈十分。
Myosin and microtubules do not contribute to strain softening肌球卵白和微管对应变软化莫得孝顺咱们还是细目肌动卵白丝在3D微组织的应变软化响应中起主要作用，但是，细胞46、47、48、49、51和微组织的机械活动也高度依赖于肌球卵白活性和微管（图7a和S12）。因此，为了评估肌球卵白和微管对应变软化的孝顺，咱们查验了用blebbistatin（Bleb）扼制肌球卵白和用nocodazole（Noco）解聚微管后的反应。
微管和肌球卵白不有助于软化。诺考达唑和blebbistatin妥协前后的微组织见（a）。微管解聚与诺考达唑移能源传感悬臂向内，标明加多预应力。相背，用blebbistatin扼制肌球卵白II使悬臂向外迁移，标明预应力镌汰。两种处理都莫得篡改应变软化量的百分比变化（B）。此外，微管解聚加多了张力规复，而肌球卵白扼制镌汰规复（c），但两种妥协都莫得篡改规复反应的时刻常数。（a）中的比例尺暗示100 μm。
用blebbistatin扼制肌球卵白可镌汰微组织硬度（N = 10，重复测量t考试，P< 0.05）和预应力（p< 0.01）（SI 2）。但是，肌球卵白扼制不影响应变软化（N = 10，重复测量t考试，P % 3 E 0.05）。正如预期的那样，它如实镌汰了张力规复的进度（图7c），因为预应力的镌汰并不令东谈主骇怪地伴跟着肌球卵白扼制。但是，由于规复率莫得变化，肌球卵白轮回不太可能是软化后规复的原因（SI 1）。尽管有可能对肌球卵白马达存在不完全扼制，但根据blebbistattin测量的剂量反应弧线（SI 3），这种情况不太可能发生。此外，即使在不完全扼制的情况下，如果肌球卵白集聚的干扰是微组织的应变软化反应的原因，那么东谈主们仍然不错预期软化反应会减少。
至于微管，与它们主若是对抗肌动卵白活性的压缩元件46、47、48、49的假定保抓一致，微管解聚加多了微组织硬度（N = 15，重复测量t考试，P < 0.001）和预应力（P < 0.001）（SI 2）。但是，就储存刚度的百分比变化而言，微管解聚对应变软化莫得影响（P > 0.05）（图7b）。正如预期的那样，它如实加多了都备张力规复（图7c），因为奉陪微管解聚的预应力加多。但是，相同，软化的分子机制不太可能受到微管解聚的影响，因为回收率莫得变化（S11）。 意念念意念念的是，飘荡拉伸如实加多了微管的重塑，在拉伸一分钟和五分钟后与静态条目有显贵各异（S14）（N = 7，重复测量t考试，隔离为p < 0.01和p < 0.05）。但是，拉伸莫得篡改每个细胞的微管团员度（SI 4）（N > 14，单要素方差分析）。
Strain softening is a conserved response for microtissues应变软化是微组织的保守反应咱们还是标明，微组织构成的3T3成纤维细胞，师法结缔组织，应变软化通过肌动卵白解聚。为了评估这种活动是成纤维细胞独到的照旧其他细胞类型共有的，咱们评估了由东谈主气谈平滑肌细胞（HASM）和骨骼肌细胞（C2C12）构成的微组织中的应变软化反应。在这方面，平滑肌和骨骼肌微组织应变软化（线性归来：隔离为R2= 0.99、0.98 P < 0.001、0.001）（图8a）。咱们还发现，骨骼肌微组织的相位滞后随应变而减小（线性归来：R2=0.99，P < 0.001），而在平滑肌微组织中莫得统计学显贵趋势（R2=0.43，P = 0.14）（图8b）。 此外，与成纤维细胞微组织肖似，HASM和C2C12微组织分享对其预应力的应变依赖性镌汰（线性归来：隔离为R2= 0.98、0.94 P < 0.001、0.01）（图8c）。遑急的是，再次对于整个细胞类型，这些响应导致不变的平均应力（线性归来：P > 0.05）（图8d），尽管它们的平均长度变化很大（线性归来：R2=0.99，P < 0.001，数据未通晓），并导致微组织延迟（即，L0随应变幅度加多而加多）（线性归来：线性归来：均R2=0.95，P < 0.01）（图8e）。
应变软化是微组织培养中的保守反应。由成纤维细胞（3T3）、东谈主气谈平滑肌（HASM）或骨骼肌（C2 C12）细胞构成的微组织均发生应变软化，其刚度（a）、相位滞后（B）和预应力（c）发生肖似变化。对于整个细胞类型，平均张力随拉伸幅度（d）不变，尽管它们的平均长度线性加多（数据未通晓）。这些活动共同导致偏移微组织长度（e）加多。3T3、HASM和C2C12微组织在拉伸住手后的储存刚度（f）和预应力（g）规复速度方面也具有相似的规复能源学。
在镌汰应变幅度后，HASM和C2C12微组织的刚度和张力规复，如先前用成纤维细胞培养物不雅察到的（图8f，g）。偏移的微组织长度也规复了（数据未通晓）。HASM细胞中刚度规复的时刻常数在统计学上大于3T3或C2C12微组织（单要素方差分析，P < 0.05）（S11）。张力规复的时刻常数两两比较吻合（单要素方差分析，P > 0.05）。
Discussion 研究在这篇著作中，咱们的主张是评估在机械和生物学上重现细胞在体内所履历的3D环境的条目下助长的细胞对急性飘荡拉伸的反应。为了竣事这一盘算推算，咱们开拓了一种新的轨范，允许高通量测量的动态力学性能和径直可视化的细胞骨架在3D微组织细胞培养。咱们的轨范包括一系列真空驱动的致动器来拉伸微组织和光学追踪力传感器来测量它们的机械活动。咱们的轨范的优点和局限性总结在SI 5中。在使用咱们的轨范，咱们标明，微组织软化动态拉伸的花样肌动卵白解聚。此外，通过这种软化活动，微组织稳态地保抓其平均张力，并导致拉伸领导的组织延迟。 在这篇著作的其余部分，咱们进一步研究这些发现中说明出的微组织，率先斟酌如何拉伸影响其力学，然后其次，这种反应的机制基础，通过拉伸领导的细胞骨架重塑。
Microtissues soften under dynamic loading微组织在动态载荷下软化咱们发现，由三种不同类型的细胞构成的活的三维微组织培养物的预应力和储能模量跟着动态应变幅度而镌汰。这一发现与先前在2D培养7、42、52和离体组织条14、15中的细胞中的报谈一致。此外，它可能反馈了一种遑急的机制，通过这种机制，组织保抓其长度，从而保抓通盘身体的稳态。举例，应变软化不错解释来自深吸气的大的潮气伸展如何概况绽开健康肺14、15中的收缩气谈而且概况有助于动脉17中的血压退换。
超过是对于ASM组织条，动态拉伸还是通晓出当有主张地围绕平均长度14飘荡时引起软化，而且当有主张地围绕平均张力15飘荡时引起伸长。相同地，当ASM组织条在助长张条目下飘荡以模拟气谈壁和实质拘谨力的被能源学时，还是报谈了显贵的延迟和软化19。诚然咱们的研究成果支抓组织条软化和延迟的这些呈报，但咱们承认气谈壁中可能存在几何和结构各异，这些各异会收缩好意思满气谈中的这些反应16。 此外，诚然畴昔的责任依赖于一个复杂的计较模子来约束伺服电机提供一个生感性的助长负荷条目19，咱们的轨范张力和长度耦合通过力传感悬臂的症结刚度。但是，也许更遑急的是，哮喘肺66中的张力增强系留力的赔本不错解释为什么莫得发生来自深吸气的正常膨大响应18。诚然面前尚不了了悬臂的弹簧常数与肺实质拘谨力确凿凿关系，但通过浮浅地篡改悬臂刚度，不错在MVAS力的进一步发展中拿获哮喘中不雅察到的变化。 尽管如斯，咱们并不以为咱们面前设想中的力和长度的耦合会影响应变软化和伸长的不雅察趋势，也不以为咱们不雅察到的微组织适应动态拉伸以保抓其平均张力。
除了软化和延迟以外，恒久以来一直有报谈称，2D培养中的离体组织条和细胞在拉伸时说明出更像流体的活动14，15，67，68，69。最近，细胞的这种流化反应与一类称为软玻璃（举例玻璃）的惰性材料的流化反应联系。泡沫、讲求乳液、糊状物和浆料）7。但是，与这些报谈和软玻璃流变学假说相背，骨骼肌和成纤维细胞微组织践诺上跟着更大的应变幅度而变得更像弹性，平滑肌微组织莫得显著的相变。因此，微组织与2D培养中的离体组织条和细胞比拟，其活动不同，或者在咱们的测量中存在期间伪影。 话虽如斯，咱们不以为原因是后者，因为弹性轨范的测量给出了如预期的轻便为零的相位滞后（S16），而且咱们的测量与肖似的3D细胞培养物中的先前报谈很好地一致34。一个更可能的原因，也可能是这项责任的局限性，是咱们在培养微组织时使用的胶原ECM与好意思满组织的构成不同，进而与好意思满组织的机械活动不同。举例，卵白聚糖约束水的质地输送，因此是能量耗散的枢纽决定要素，咱们莫得将其纳入咱们的微组织中。此外，在这方面，在去除大部分细胞组分后，用CytoD处理，主要姿首基质孝顺的剩余机械活动是弹性的，对能量耗散孝顺很小（S12）。 因此，当细胞软化（而且可能流化）时，可能还是感知到更肖似弹性的活动，因为与弹性基质比拟，细胞对全体机械活动的孝顺变得不那么显贵。其他可能的解释包括在应力-应变弧线上评估力学的位置各异，以及由体内抓续机械退换引起的微组织和离体样品之间的结构各异。尽管如斯，在改日的责任中，仍然有兴味评估微组织是否撤职相通的时刻轨范不变性71，该时刻轨范不变性71还是牵引了细胞的机械活动撤职Sollich（1997）对于软玻璃流变学的表面72的假定。
应变住手后，咱们发现，微组织刚度规复到侵略前的值沿着保存邃密的轨迹，不错在三个量级的时刻与拉伸指数建模。拉伸指数先前已被用于姿首无序系统73、74中的弛豫历程，而且不错从具有弛豫时刻的非粗莽分散75的浮浅指数函数的线性叠加出现。因此，从细胞骨架的复杂性质和斟酌细胞蚁集体时产生的迥殊复杂性来看，这种功能可能出现并不令东谈主过分骇怪。尽管如斯，咱们发现，对于整个通晓规复响应和细胞类型的测试处理，预应力和刚度的规复时刻常数在35和43秒之间（除了HASM微组织中的刚度规复）。 这个时刻常数似乎是在相通的数目级，如先前报谈的规复皮质肌动卵白刚度后，在二维培养细胞一霎拉伸7。难受的是，这项责任的作家莫得将他们的弧线拟合到拉伸的指数。但是，他们承认，规复发生的时刻轨范跟着拉伸住手后的时刻而增长，而且比指数历程慢，这是拉伸指数的特征。
咱们以为，上述这些反应与先前在3D细胞培养物中报谈的响应于准静态负载的张力稳态活动联系29，30。在这方面，已知细胞将篡改其里面收缩性以对抗外部机械负荷以保管设定点张力。为了与这一见解保抓一致，咱们发现适应邃密的微组织的预应力和刚度的镌汰足以在越来越大的应变幅度和越来越大的平均长度下保抓恒定的平均张力。因此，也许最遑急的是，咱们的责任扩展张力稳态的条目下，动态施加负载。 此外，咱们发现，适应性反应发生在生理负荷率，但算作一个不错预期的生物体概况确立，它是不存在时，负荷施加慢于张力和刚度规复时刻常数。
在文件中，应变软化存在于一个悖论中，大量的研究呈报了应变硬化和肌动卵白增强对拉伸的反应53。在抓续拉伸或沿应力-应变弧线查验沿着不同位置时，重构的交联肌动卵白凝胶54、55、细胞56和3D细胞培养物34、57都通晓出应变。这种非线性效应由肌动卵白丝54、55的重组引起，而且对于组织，由细胞的重新定向和这些局部效应穿过细胞培养物57的浸透引起。诚然咱们的加载回路大部分是线性的，但在大应变幅下不错在一定进度上不雅察到力-应变回路中通过非线性的应变硬化（来自非线性的总谐波失真从0.041 ± 0.002至9%应变下的0.152 ± 0.004（P < 0.0001，重复测量t考试））。但是，这种影响小于动态加载产生的软化活动。另一方面，还是报谈了卑劣信号级联通过肌动卵白微丝增强52、58、59、60、61、62算作一种负反馈引起机械硬化，以保管局部机械应力63、64。在这方面，微组织先前还是通晓出在动态拉伸15分钟后发生变形38、65。咱们还报谈了在慢性（2天）条目下微组织中的肌动卵白强化40。 遑急的是，在这些看望中，准静态刚度测量和f-肌动卵白抒发进行了评估后，负载和一段时刻后大于刚度规复和肌动卵白再团员的时刻轨范，咱们在这里报谈。也便是说，在咱们相对较短的实验窗口内，咱们莫得不雅察到运行和完全规复的刚度、预应力、长度和f-肌动卵白抒发测量之间的任何各异。
Stretch depolymerizes actin in microtissues拉伸解聚微组织中的肌动卵白诚然细胞和组织的应变软化已被平素报谈7，14，15，42，52，这种反应背后的分子机制仍不了了。在这里，咱们看望的孝顺肌动卵白微丝，肌球卵白II电机和微管。这篇著作的其余部分是一个研究，涵盖了这些细胞骨架元素中的每一个在动态载荷下的细胞和组织的力学活动的孝顺。
率先，在细胞中，肌动卵白细胞骨架是一种丝状集聚，它赋予细胞花样并抵御张力。在2D培养中，还是报谈了细胞的拉伸使肌动卵白丝脱髓鞘9，10，11。咱们在3D培养微组织中的成果倾向于与这些不雅察成果一致。简而言之，咱们发现1）f-肌动卵白是应变软化和规复反应所必需的; 2）活细胞中的肌动卵白重塑随拉伸而加多; 3）短期拉伸镌汰f-肌动卵白抒发; 4）拉伸住手后，f-肌动卵白抒发沿着规复，与张力和刚度规复相通。这些研究成果热烈标明，应变软化，至少部分，来自肌动卵白解聚。 咱们不雅察到的周期性拉伸住手后肌动卵白再团员的时刻轨范也与先前报谈的3D细胞培养物中步长变化31和分离细胞中一霎拉伸12，13后的测量成果一致。
诚然肌动卵白的退换波及多种卵白质，并莫得完全贯串，应变领导的肌动卵白解聚最近已被相接到加多cofilin活性。在这方面，在2D培养中敲低细胞中的这种肌动卵白割断分子，减少软化，而且它们的肌动卵白丝在一霎拉伸后基本上保抓好意思满13。此外，肌球卵白Ib最近被讲授不错算作一种拿获集聚的肌动卵白解聚酶（其对肌动卵白的亲和力，因此其应力纤维割断能力，跟着施加的载荷而热烈加多）76，因此也不错促进细胞和组织的应变软化活动。另一方面，肌动卵白的规复反应可能部分介导的zyxin促进应力纤维确立。 在这方面，先前还是标明，zyxin定位于应力纤维断裂的位点，而且zyxin的敲低镌汰了单细胞中收缩力的规复，并导致拉伸12后精确凿割的肺切片中更快速的膨大。在咱们的MVAS力安装中评估这些卵白质可能会进一步了解它们对细胞骨架和组织力学特点的动态退换的孝顺，因此，应该是改日研究的重心。
接下来对于肌球卵白II马达，它们通过交联和主动拉动肌动卵白丝产生张力来退换细胞的机械活动。重建肌动卵白-肌球卵白集聚会的应变软化归因于肌球卵白交联的絮叨43，44，45。在气谈组织条14、15中的软化反应中也波及到肌球卵白集聚的扰动。但是，与这些报谈相背，咱们发现微组织的软化对肌球卵白活性是不变的，而且应变住手后的规复反应速度莫得变化。这热烈标明，肌球卵白在3D培养中细胞的软化反应中莫得作用。
终末，对于微管，尽管咱们对它们在细胞力学中的作用的贯串仍在络续完善77，但东谈主们以为它们充任了对抗肌动卵白-肌球卵白收缩性的压缩援救，如张拉全体结构46，47，48，49。因此，与其他几项在2D中测量细胞牵引力和刚度的研究一致46，78，咱们发现用诺考达唑解聚微管加多了微组织刚度和预应力（S12）。相对较少的研究评估了拉伸细胞和组织如何影响微管重塑和团员。也便是说，当细胞变形时，不错看到微管症结48，而且在2D培养中助长的轴突中，微管还是被讲授在大的（75%）动态载荷下解析79。 相背，咱们莫得不雅察到微管团员的任何变化，诺考达唑处理对软化反应莫得影响。但是，动态拉伸如实加多了微管重塑。拉伸是否径直导致微管的重排，或者它们只是根据肌动卵白解聚而重塑，以及所不雅察到的微管重塑是否有助于细胞力学活动的变化，是改日研究的意念念意念念问题。
Conclusions 论断在本文中，咱们冷漠了一种新的高通量轨范，用于评估动态细胞力学并可视化亚细胞水平的重塑，以响应生理关系3D微组织培养物中的拉伸。咱们的轨范提供了将2D培养中不雅察到的活动与软3D基质中的细胞（与东谈主体组织十分）谈论起来的能力，并将细胞骨架的视觉重塑与机械性能的变化谈论起来。在这方面，咱们发现，成纤维细胞，平滑肌和骨骼微组织培养物都有一个保守的软化反当令，动态拉伸和规复后的拉伸住手。微组织的反应，以保抓其平均应力，并在助长素的条目下，他们的反应导致延迟。此外，通过径直定量细胞骨架重塑，这些活动似乎是由快速肌动卵白解聚引起的。 这标明肌动卵白微丝是细胞中机械拉伸的传感器，而且反过来，造成反馈回路以约束组织的机械张力。细胞感受和反应来自其环境的机械刺激的能力是保管体内稳态的遑急机制，因此，对咱们轨范的进一步斟酌可能会揭示充分贯串很多病感性疾病的枢纽方面。
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