澳门六合彩开奖结果记录 Doric Lenses植入式光纤用于目田迁移小鼠光遗传学限定的多通谈读数
光遗传学的最新进展进步了在目田迁移的哺乳动物中对特定电路元件进行光学限定的精度;绝顶是，重组酶依赖性视卵白病毒与束缚增长的抒发重组酶的转基因小鼠一齐使用，允许对特定细胞类型进行操作。关联词，尽管光遗传学限定允许以越来越庞杂的方式主宰神经回路，但在目田迁移的小鼠中，将光遗传学刺激与沉静单元的同步多通谈电生理读数相迎阿仍然是一个挑战。咱们筹备并考据了 optetrode，这是一种允许在目田迁移的小鼠中进行共定位多 tetrode 电生理记载和光学刺激的安装。Optetrode 制造领受独有的以光纤为中心的同轴筹备方法，可坐蓐出分量轻 （2 g）、紧凑且坚固的开辟，适用于行动风雅的小鼠。这种低老本开辟易于构建（无需专用开辟即可构建 2.5 小时）。咱们发现驱动筹备产生了褂讪的高质地灌音，并在植入后至少 6 周内执续保执这种景况。咱们通过量化内侧前额叶皮层细胞对局部光学激勉和禁绝的反应来考据 optetrode，在旷场探索期间探伤小鼠中多种不同遗传界说的细胞类别。
一、关联数据
作为动物受试者1（animal subject），小鼠为磋议从学习到酬酢阐发2,3 的行动提供了一个颠倒种种化的遗传平台，包括光遗传学4-8。绝顶是，病毒抒发靶向（使用启动子或 Cre 驱动细胞系 9-12 与 Cre 依赖性病毒13-15 的组合）大约对小鼠行动进行高精度的光遗传学磋议。关联词，在目田迁移的小鼠中，在光遗传学操作期间同期记载多个电行径通谈的才智有限，因此即兴了对神经回路影响的详备贯通。磋议东谈主员在体外（脑切片和细胞培养）和体内麻醉 16 中平庸领受电生理学来测量光刺激对神经放电的影响。关联词，切片和麻醉的大脑与当然澄澈景况的大脑明显不同17。因此，理念念情况下，在目田迁移的行动经由中必须不雅察和扰动神经行径，以将特定神经景况与行动景况相关联并因果关系化。
张开剩余95%尽管高通量清闪耀田迁移电生理学的方法关于大型动物（举例大鼠18-25）很容易得回，但由于小鼠不错佩戴的植入物的大小和分量有限，将多个沉静单元的电生理记载与清闪耀田迁移小鼠的光学硬件相迎阿仍然是一个挑战26。最近，好多首创性的奋勉推动了小鼠澄澈电生理学开辟的开发，尽管其中好多植入物与光遗传学方法27,28 不相容，或者由于植入物的尺寸和分量，需要在记载期间固定小鼠29 头部。咱们筹备、考据并使用了 optetrode，一种小型驱动器 optrode，故意针对将目田迁移的小鼠电生理学与光遗传学限定相迎阿的收尾和挑战量身定制。
二、效果
2.1 Optetrode 筹备和考据
鉴于光遗传学履行从根底上依赖于向大脑的光传输，咱们从开辟中心的光纤起初（图 1a）。关于电生理记载，该开辟配备了 16 根微线（团员物涂层镍铬合金，直径 12 μm），缠绕成四个19,20（直径，~25 μm）的四极敛迹，以促进从光传输区域中的单个神经元进犯信号。为了确保记载站点隔壁一致且饱和的光强度，咱们将四极敛迹刚性聚首到光纤轴（直径，~200 μm）并切割它们以超出光纤结尾 300-1,000 μm。高纤维直径与四极管直径之比 （200：25） 确保四极敛迹对后光的暗影不错忽略不计。因此，纤维在通过脑组织的翻译经由中既充任光源，又充任四极管的结构支执。由此产生的光纤四极管组件与定制的同轴机械驱动器相迎阿，从而允许在植入后主宰记载位点。驱动器筹备由一个透风螺钉、一个拇指螺母和一个塑料外壳构成。纤维四极管组件齐心穿过透风螺钉，透风螺钉的加工使塑料外壳费劲其旋转（图 1b）。因此，拇指螺母的旋转将螺钉和纤维四极管组件同轴平移（不旋转）穿过大脑（图 1c;拇指螺母每转一整圈对应于 454 μm 的深度穿透）。这种机械筹备产生了一种组合的光刺激和电子记载开辟（图 D）。1a） 分量适中（完成时 2 克，植入时 ~2.5 克，包括将安装固定在双桨上的丙烯酸的分量）和空间尺寸（高度，22 毫米）。咱们发现目田迁移的成年小鼠 （≥5 周龄） 很容易佩戴植入的安装 （图 1d 和在线方法）。
图1.Optetrode 筹备。（a） Optetrode 的垂直横截面。该开辟的主体由一个塑料外壳和一个翼形螺钉构成，用两个摩擦和解的塑料销牢牢地固定到位，机械驱动一个透风螺钉，其中包含四个四极管和多模光纤的保护管被粘合到该螺钉中。螺钉头在光纤的金属套圈光纤聚首器端和电子接口板上都涂有环氧树脂，该板将四极线微线聚首到 18 针电气聚首器。插入的光纤水平横截面，附有四个四极敛迹。（b） 机械驱动器垂直于 a 中横截面的垂直横截面。透风螺钉的下半部分被减薄，使其仅在一个可能的方朝上与塑料外壳的正大紧密贴合，因此在垂直贯通经由中不会旋转。（c） Optetrode 中使用的机械驱动的三维视图。由于干预销会费劲翼形螺钉的垂直平移，因此逆时针场所动弹会导致透风螺钉向下贯通（红色箭头）。（d） 所示为一只 10 周龄的野生型雄性小鼠，在打针 optetrode 和 2 周后（小鼠手术时为 8 周龄）。（e） 四极敛迹两个通谈上的动作电位振幅自大了五个振幅簇（花样编码）。来自最大幅度通谈的平均动作电位波形自大在每个集群的独揽。未蚁集的峰值不会自大。
为了测试 optetrode 安装对澄澈记载神经行径的遵守，咱们起初将该安装植入小鼠 （n = 3） 的内侧前额叶皮层 （mPFC），这些小鼠之前打针了腺相关病毒 （AAV5） 佩戴编码增强型黄色荧光卵白 （EYFP） 的基因。当小鼠实行旷场探索任务时，咱们记载了来自 16 根微线的信号 （OFT，参见在线方法）。在每个四极管的四根导线中的每一根导线上测量的单个尖峰事件的振幅变成了振幅值18,19 的簇（图 1e），咱们使用两个程序目的30：L 比和进犯距离评估了这些簇的质地。L 比小于 0.2 且进犯距离大于 15 的集群被视为单个单元（参见在线方法;n = 45 个来自 43 个 OFT 履行的单个单元，单个单元 L 比 = 0.03 ± 0.04，进犯距离 = 47.2 ± 24.1，平均值 ± 程序偏差）。为了评估这些单个单元在 22 分钟 OFT 上的褂讪性，咱们检讨了 OFT 中前 2 分钟的尖峰振幅与临了 2 分钟的尖峰振幅的分离性。咱们发现，从任务起初和结束的尖峰簇彼此之间从来莫得很好地分开（最小 L 比 = 0.92，平均 ± 程序偏差 = 4.9 ± 3.7;最大进犯距离 = 8.2，平均±程序偏差 = 4.0 ± 1.4），这标明驱动器筹备产生了褂讪的记载。此外，咱们发现该驱动器大约在至少 6 周的时辰限制内记载来自合并站点的高质地信号（补充图 1）。
2.2 目田迁移小鼠的光学禁绝期间的记载
咱们接下来测试了该开辟在抒发视卵白的澄澈行动小鼠中记载神经信号的才智。起初，咱们起初磋议了抒发盐视紫红质 eNpHR3.0 的小鼠的阐发，该反应已被阐述在体内记载期间禁绝动作电位15，但尚未在目田迁移的哺乳动物中进行检讨。咱们将该安装植入小鼠 （n = 2） 体内，该小鼠打针了含有编码 eNpHR3.0-EYFP 交融卵白的基因的 AAV，该 AAV 在东谈主突触卵白启动子 （hSyn） 的限定下，一种平庸抒发的神经元启动子（补充图 2）。将小鼠置于空旷状貌中 18 分钟，并显露于 30 秒的照明脉冲（λ = 561 nm，连气儿光，植入光纤顶端的功率密度为 160-260 mW mm-2,0.5 mm 处为 17-26 mW mm-2，纤维下方 1 mm 处为 4-7 mW mm-2 31，32） 被 90 秒的昏黑纪元相隔。咱们发现，平均而言，多单元活性减少了 26.6 ± 6.8%（平均值 ± s.d.，n = 14 个 OFT 的 40 个四极细胞记载位点，P < 0.001，t 磨砺; 图 2a）在照明时期。咱们大约在 14 次 OFT 曝光期间分离出 23 个单个单元，况兼在光照期间果然通盘细胞中都存在进犯（23 个细胞中有 21 个在光照期间不时闲适簇质地阈值;在线方法和图 2b）。
2.3 在单独的窗口中通达
图 2.Optetrode 在 OFT 期间的平庸光遗传学刺激期间促进了电生理学。（A-E）野生型 （WT） 小鼠用 AAV5-hSyn：：eNpHR3.0-EYFP 转导。平均 MUA 以 1 Hz （a） 的速率分箱。暗影区域线路 s.e.m.（n = 30 个四极管记载站点，14 个 OFT）。绘画了无光刺激和光刺激期间的簇的 L 比值（左）和进犯距离（右）（n = 23 个簇，b）。栅格图（上图）和相应的归一化放电速率弧线（下）自大了被绿光热烈禁绝的神经元 （c）、起初被绿光禁绝但其行径在刺激时期 （d） 的执续时辰内规复的神经元，以及被绿光激勉的神经元 （e）。（f-k）野生型小鼠用 AAV5-hSyn：：ChR2-EYFP 转导。平均 MUA 在 1 Hz 或 10 Hz 刑事累赘档（n = 40 个四极线记载位点，10 个 OFT;f， g） 的暗影区域线路 s.e.m.绘画无光刺激和光刺激期间的簇的 L 比值（顶部）和进犯距离（底部）（n = 21 个簇，h）。自大了在 5 Hz（顶部）和 20 Hz（底部）刺激期间保执高簇质地和与光脉冲相关性的神经元示例 （i）。栅格图（顶部）自大了示例 神经元在 5 Hz 和 20 Hz 刺激期间相关于每个光脉冲起初的尖峰时辰，以及相应的脉冲触发平均辐射速率（底部）。唯有被归类为在莫得光刺激的情况下风雅进犯的簇（参见在线方法）才在 b-e 和 h-k 中绘画。水平虚线线路高度进犯的集群的截止值。
21 个分离的细胞包括活性立即受到禁绝的细胞（放电率裁汰 68% ± 15%，平均 ± sd，n = 6 分，21 分 < z -1.3），活性磨蹭增强的细胞，可能是由于回路效应的效果（放电率增多 137% ± 56%，平均 ± s.d.，n = 4 分，21 分 > 1.3），以及莫得不雅察到光的统计学明显影响的细胞（P > 0.1，t test） 的在那些受光影响的细胞中，对照明之前、期间和之后的单个神经元放电速率能源学的检讨揭示了响应照明的复杂能源学。一些神经元被光热烈地立即禁绝（图 2c），一些神经元起初立即被光禁绝，但在 30 秒的照明时期规复了活性（图 2d），其他神经元在电路照明下徐徐被激勉（图 2e）。这些发现阐述了 optetrode 在拿获行动小鼠中光遗传学指引的神经行径的复杂变化的后劲，在这种情况下，这些变化是由目田迁移的动物中光遗传学禁绝的初度记载指引的，这是一个永恒寻求的主见。
2.4 在目田迁移的小鼠的光学激勉经由中进行记载
接下来，咱们探索了在目田迁移的小鼠的一系列刺激参数上将电记载与光刺激相迎阿。在植入 optetrode 之前，咱们再次在 hSyn 启动子的限定下，将小鼠 （n = 2） 打针到含有通谈视紫红质 2 （ChR2）-EYFP 交融卵白的 AAV 的 mPFC 中（补充图 2）。这些小鼠进行了 18 分钟的 OFT，在此期间，30 秒的光学限定时期被 120 秒的无光传递闭幕 （n = 10 OFT） 离隔。光学限定的纪元由不同频率的脉冲激光构成（激光波长 λ = 473 nm，脉冲宽度 5 ms，注入光纤顶端的功率密度 60-160 mW mm-2，对应于光纤下方 0.5 mm 处的揣摸功率密度为 5-12 mW mm-2，在光纤下方 1 mm 处为 1-3 mW mm-2， 在四极管顶端）。在每次 OFT 期间，在以下生理和临床相关的刺激频率上对脉冲频率进行两次扫描：低 （5 Hz）、中 （20 Hz） 和高 （130 Hz;脑深部刺激33-35，DBS）。这些刺激模式平常在系统神经科学和临床医学中从传统电极传递，但事实阐述，由于电刺激会引起电伪影，尤其是在较高频率下，很难敬佩局部神经对刺激的反应。尽管使用 Ca2+ 成像技巧了解电刺激雠敌部固定动物的影响照旧取得了进展36，但光遗传学刺激使咱们大约幸免电伪影并同期记载局部神经行径。
即使在 130 Hz 下，咱们也大约不雅察到多单元神经对光刺激的反应（图 2f）。多单元行径（MUA，参见在线方法）通过 20 Hz 刺激（增多 115.7 ± 18.6%，平均 ± s.d.，n = 40 个 tetrode 记载位点，10 个 OFTs，P < 0.0001）和 130 Hz 刺激（37.1 ± 11.7%，平均 ± s.d.，P < 0.005）显贵增多，并起初在 5 Hz 刺激下飞动（MUA 以更精真金不怕火的分辨率分档;图 2g）。在 130 Hz 刺激的第一秒内，MUA 出现急剧尖峰，随后下跌到延迟、激勉较少的阶段（图 2g）。这个延迟期频繁受到禁绝并执续跳跃刺激期，这一发当今解释 DBS 机制方面具有十分大的临床真谛真谛（补充图 3）。在刺激经由中也不错分离一些单个单元，但在 ChR2 促进的光刺激期间增多的多单元布景和尖峰振幅的变化使得好多单元的进犯变得贫困。这响应在刺激期间簇质地目的的裁汰（图 2h）。尽管如斯，好多单元在刺激期间仍然保执风雅进犯（21 个单元中的 9 个，10 个 OFT;图 2i-k 和补充图 4）。
在 ChR2 介导的刺激经由中，充分分离的单个单元数目减少的一种可能解释是 ChR2 基因是由平庸抒发的 hSyn 启动子37 驱动的。通过在更特定的神经元群中抒发 ChR2 的小鼠中测试 optetrode（也与光遗传学平常与 optetrode 迎阿使用的方式更一致），咱们假定咱们不错进步光刺激期间的簇质地。咱们将 optetrode 驱动器植入另外两类小鼠中：在更特异性启动子 （CaMKIIα） 下抒发 ChR2 的小鼠和在抒发微小白卵白的神经元中以重组酶依赖性靶向方式抒发 ChR2 的小鼠（PV：：Cre 转基因系）;在这两种情况下，咱们都像之前的履行一样将 AAV5 打针到 mPFC 中（补充图 5 和 6）。
咱们使用与 hSyn 小鼠疏导的履行决策，将打针 AAV5-CaMKIIα：：ChR2-EYFP 的小鼠打针到 mPFC （n = 2） 中进行 22 分钟的 OFT，但使用 2 毫秒脉冲宽度而不是 5 毫秒的出奇 130 Hz 刺激时期。这个出奇的 epoch 旨在减少高频刺激的占空比，该款式与临床 DBS 更相关。咱们还赶紧化了种种刺激频率的划定（激光波长 λ = 473 nm，植入光纤顶端的功率密度 = 96 mW mm-2，对应于 0.5 mm 处的揣摸功率密度为 9 mW mm-2 和纤维下方 2 mm 处 2 mW mm-2，在四极管顶端）。不异，咱们不雅察到在 20 Hz 刺激期间 MUA 增多（增多 173%，n = 84 个 OFT 中的 33 个四极线记载位点;图 3a）和 5 Hz 刺激期间的飞动 MUA（图 3b）。咱们发现 CaMKIIα：：EYFP 在职何刺激频率下 MUA 均无显贵变化 （P > 0.2）。关联词，与 hSyn 启动子比较，在 CaMKIIα 启动子的限定下，抒发 ChR2 的小鼠的 130 Hz 反应在驱动峰值后并未裁汰至基线（图 3a）。在光刺激期间，沉静神经元的聚类质地发生了变化（14 个单元中有 7 个保执沉静，n = 33 OFT;图 3c），但在保执进犯的细胞中不错不雅察到对单个光脉冲的热烈响应（举例，消散期 = 4.9 ± 0.3 毫秒，平均值 ± 程序偏差;Fig. 3d–f） 的
图 3.在 OFT 的布景下，Optetrode 促进了细胞类型特异性光遗传学刺激期间的电生理学。（a-f）野生型小鼠用 AAV5-CaMKIIα：：ChR2-EYFP 转导。平均 MUA 以 1 Hz （a） 和 10 Hz （b） 的速率分箱。暗影区域线路 s.e.m.（n = 84 个四极管记载站点，33 个 OFT）。绘画了莫得光刺激和光刺激期间的簇的 L 比值（顶部）和进犯距离（底部）（n = 14 个簇，c）。自大了一个示例神经元，它在 5 Hz（左）和 20 Hz（右）光刺激 （d） 期间保执了高簇质地和与光脉冲的相关性。尖峰时辰（左）和脉冲触发的平均辐射速率（右）的光栅图自大了一个示例神经元在 5 Hz （e） 和 20 Hz （f） 刺激期间相关于每个光脉冲起初的栅格图。（g-k）用 AAV5–DIO-EF1α：：ChR2-EYFP 转导 PV：：Cre 转基因小鼠。平均 MUA 以 1 Hz （g） 分档。暗影区域线路 s.e.m.（n = 45 个四极线记载站点，29 个 OFT）。在莫得光刺激和光刺激期间绘画 L 比值（左）和进犯距离（右）（n = 50 个簇，h）。一个例子自大，神经元在响应 5 Hz（左）和 20 Hz（右）刺激抒发小白卵白的细胞 （i） 时保执高簇质地和裁汰的放电率。自大了示例 神经元在 5 Hz （j） 和 20 Hz （k） 刺激期间相关于每个光脉冲起初的尖峰时辰（左）和脉冲触发平均辐射速率（右）的光栅图。唯有被归类为在莫得光刺激的情况下风雅进犯的簇（参见在线方法）才被绘画在 c-f 和 h-k 中。水平虚线线路整个进犯的集群的截止值。
为了进一步探索 optetrode 在 ChR2 驱动的光学激勉经由均分离单个神经元的才智，咱们探讨了刺激禁绝性中间神经元（即抒发小白卵白的细胞）的脱落神经元群的影响。咱们再次在 mPFC 中植入 optetrodes;关联词，咱们莫得使用野生型小鼠，而是在 EF1α 启动子13,14 的限定下，向 PV：：Cre 小鼠 （n = 2）38 打针了佩戴 loxP 侧翼 ChR2-EYFP 交融构建体 （DIO） 的 AAV5。DIO 构建体允许主见卵白仅在抒发 Cre 重组酶的细胞中抒发（补充图 6）。咱们对小鼠进行了与抒发 CaMKIIα：：ChR2 的小鼠疏导的 OFT 决策，并记载了局部 MUA （图 3g） 和单单元活性。在这种情况下，保执高簇质地的才智果然不受光刺激的影响（图 3h），允许在光刺激期间不雅察到果然通盘被分离的单个单元（n = 29 个 OFT 中 50 个单个单元中的 46 个;图 3h，参见在线方法）。值得提神的是，在这种情况下，咱们不雅察到这些小鼠在光刺激期间对平均 MUA 果然莫得影响（图 3g），但单个单元（图 3i）对单个光脉冲阐发出热烈的反应，举例瞬态禁绝（图 3j、k 和补充图 7）。这些单元在响应光时都莫得阐发出低抖动动作电位，标明它们不是抒发 ChR2 的小白卵白阳性神经元。相背，十分多的单元对光阐发出平庸和延迟的禁绝 （P < 0.0005，二项式磨砺;46 个神经元中有 9 个自大放电率裁汰，P < 0.05，Bonferroni 阅兵 t 磨砺;图 3j、k），正如得胜召募小白卵白阳性14 神经元行径的突触或多突触效应所预期的那样。事实上，在小白卵白阳性 EYFP 对照小鼠中记载的神经元莫得自大出响应光的放电速率变化 （n = 3 只小鼠，29 个神经元中的 0 只，P > 0.05;在线方法）。
2.5 光学激勉期间的鼠标行动
optetrode 驱动器筹备的一个要津特质是它保执饱和小和轻，可用于目田行动的小鼠。咱们大约同期探索 mPFC 中的光刺激对 OFT 中神经行径和行动的影响。咱们分析了 22 分钟 OFT 期间行动的两个方面：小鼠速率和小鼠占据笼子中心的时辰段，这是对高傲相关行动的经过考据的测量39。咱们计较了每个 OFT 的第一个光刺激时期之前以及不同频率和脉宽刺激时期期间和之后的平均速率。值得提神的是，咱们发当今振奋性神经元 （CaMKIIα：：ChR2） 中抒发 ChR2 的小鼠在 20 Hz 和 130 Hz 刺激期间阐发出速率增多（P < 0.0001 关于 20 和 130 Hz，5 毫秒脉宽刺激;P < 0.02 关于 130 Hz，2 毫秒脉宽;Bonferroni 阅兵 t 磨砺;图 4a）因此在刺激期间具有更长的旅途长度（图 4b），但在 5 Hz 刺激期间莫得发生这种增多。这种模式与产生 MUA 增多的刺激频率一致（图 4c）。另一方面，EYFP 无视卵白对照对平均 MUA 或速率莫得阐发出任何光的影响。往时的磋议16,40 不雅察到皮层光学刺激的贯通变化，但至关紧要的是，在不雅察到的行动效应期间无法提供关联局部神经元行径的信息;使用 Optetrode，您不错得回此信息。
图 4.OFT 期间光遗传学刺激的行动和神经行径影响。小鼠领受 22 分钟的 OFT 并每 2 分钟显露于 30 秒的光刺激时期。咱们使用 5 Hz、20 Hz、130 Hz 和 5 ms 脉冲宽度和 130 Hz 2 ms 脉冲宽度作为刺激参数。每种刺激类型正值使用了两次，况兼划定是赶紧的。（a） CaMKIIα：：ChR2-EYFP （n = 2 只小鼠 33 个 OFTs 的 84 个四旋线记载位点）和 CaMKIIα：：EYFP 小鼠 （n = 3 只小鼠 43 个 OFTs 的 119 个四极线记载位点） 在每个刺激时期和之后在 mPFC 中。*P < 0.05，***P < 0.001。（b） 示例 OFT 轨迹自大小鼠在刺激前 30 秒内（上）和 20 Hz 刺激 30 秒内（下）的旅途。（c， d）数据线路为归一化平均多单元射击率 （c） 和在旷地中心破耗的时辰百分比 （d）。通盘过失线均线路 s.e.m.
为了量化在旷场中心破耗的时辰，咱们计较了鼠标距离旷场框最近一侧跳跃 10 cm 的每个纪元的分数。咱们发现，与 CaMKIIα：：EYFP 对照小鼠比较，光刺激款式对 CaMKIIα：：ChR2 小鼠在旷场中心停留的时辰莫得平均影响 （P > 0.1;图 4d），尽管两种类型的小鼠在起初的 2 分钟刺激前阶段在中心破耗的时辰都比随后的时期少，这标明它们当然地妥贴了磁场（P < 0.05;图 4d）。咱们对在小白卵白阳性细胞中抒发 ChR2 的小鼠进行了疏导的分析，咱们莫得不雅察到光刺激对动物速率、在中心停留的时辰或记载的 MUA 的平均影响（补充图 8）。
2.6 在目田迁移的小鼠中记载界说的神经投射
Optetrode 方法不消局限于记载含有抒发视卵白的细胞体的区域的行径，而且原则上不错推广到从经受来私用视卵白转导的汉典大脑区域的投射的细胞进行记载。在临了一组履行中，咱们测试了 optetrode 在大脑区域之间驱动特定神经投射并评估这些投射对目田迁移的小鼠的功能影响的才智。咱们在 CaMKIIα 启动子的限定下将编码 ChR2-EYFP 的 AAV5 打针到基底外侧杏仁核 （BLA） 中，但莫得将 Optetrode 植入 BLA，而是将 Optetrode 扬弃在前面际 （PrL） 新皮层上方。在这种情况下，不错记载 PrL 神经元的行径，同期刺激从 BLA 投射到 mPFC41，其中 PrL 是其中的一部分（图 5a）。这种投影靶向政策关于能很好地运送到轴突6、15、16 的视卵白是可行的。
图 5.Optetrode 投影靶向：将轴突输入从 BLA 驱动到 mPFC。（a） 自大 BLA 到 mPFC 投影主见的默示图。（b） PrL 神经元的自愿行径自大在 1 秒的时辰窗口内。（c） 在 b 中自大了记载的平均动作电位款式。暗影区域线路平均值的 s.e.m.。（d） 对 b 中单元的辐射速率进行自相关分析，自大在 ≤1 s. a.u. 的圭臬上，即兴单元的辐射模式莫得明显的周期性。（e） BLA 到 mPFC 投影的光刺激在 b 中诱发了该单元的动作电位以及复杂的多单元反应（数据未自大）。（f） 以 e 线路记载的平均动作电位款式。（g） 自相关分析自大，该安装在目田迁移的旷场勘测期间以 10 Hz 的周期性辐射，与施加的光学刺激相关。在注入光纤顶端领受激光 λ = 473 nm，脉冲宽度为 5 ms，速率为 10 Hz，功率密度为 80 mW mm-2（在光纤下方 0.5 mm 处为 6 mW mm-2，在光纤下方 1 mm 处为 1 mW mm-2，在四极管顶端处）。
PrL 单元的布景活性（图 5b、c）自大其辐射模式中莫得潜在的周期性（图 5d）。关联词，当使用蓝光 （λ = 473 nm） 的 10 Hz 刺激将 BLA 投影驱动到 mPFC 中时，沉静单元自大出时辰模式的显贵变化（图 5e），保执疏导的尖峰波形（图 5f）。在光学投影刺激期间该单元的记载的自相关自大 0.1 秒的周期性，与 10 Hz 刺激一致（图 5g）。除了单个单元与激光脉冲的同步外，刺激还产生了复杂的多单元响应，这些响应在这些目田行动的小鼠中不雅察到的单元（数据未自大）同步触发之前（但不影响进犯）。
三、推敲
将光遗传学限定的精度与单单元神经能源学的电生理读数相迎阿，关于寻求建筑因果关系和加深对神经回路能源学的贯通的行动履行至关紧要。咱们开发了一种 optrode 安装 optetrode，它允许在澄澈的目田迁移小鼠中同期进行光学筹商和 tetrode 电生理学。Optetrode 的一个要津特质是其以光纤为中心的筹备，允许使用单螺杆驱动在 4 mm 的脑深限制内传播光纤和四极管（图 1a-c）。这种机械驱动筹备减小了开辟的尺寸和分量，并允许目田迁移的鼠标欣喜地佩戴它。咱们和其他东谈主最近在行动小鼠中阐述了光遗传学限定和多单元记载的42,43 整合，但败落通过合并动物的多个大脑区域以固定且可计算的空间关系将光源和记载电极共同鼓吹的才智;事实上，Optetrode 中的光纤还不错兼作四极管的结构支执，从而大约准确、安详地靶向深部大脑结构。此外，Optetrode 以低老本将目田迁移的小鼠电生理学与光遗传学相迎阿，况兼制造款式下里巴人，不需要故意的设施。
咱们通过初度量化目田迁移小鼠中光学禁绝或激勉特定局部 mPFC 细胞的生理效应来考据 optetrode。从 halorhodopsin 的作用机制来看，通过 eNpHR3.0 激活不雅察到的对神经行径的热烈禁绝（图 2a）是预期的。关联词，Optetrode 在光刺激期间记载单个神经元行径的才智（图 2b）揭示了局部采聚首反应的种种性（图 2c-e）。被光立即和执续禁绝的神经元（图 2c）很可能抒发 eNpHR3.0，况兼它们的放电反应由 eNpHR3.0 介导的氯离子电流主导。比较之下，在照明期间阐发出较高放电速率的神经元（图 2e）可能经受到来自禁绝性神经元的输入，这些神经元平常会禁绝其行径，但会受到光的禁绝。因此，这些神经元的放电能源学仅转折受到 eNpHR3.0 对光的反应的影响。不异，好多单元在照明下辐射速率的驱动快速 （<100 ms） 裁汰 （图 2d） 可能是 eNpHR3.0 抒发和功能的效果，然而，与 eNpHR3.0 能源学不匹配的后续能源学可能受汇集行径的限定。值得提神的是，咱们发现被禁绝的神经元阐发出颠倒快的禁绝起病时辰，这与已知的快速泵送机制一致。这一发现支执这些哺乳动物制剂中光遗传学禁绝的径直和细胞内在模式。与光遗传学激勉一样，在光遗传学操作经由中，若是莫得同期多通谈读数，将很难在目田迁移的小鼠中识别这些特质。
正如预期的那样，在 ChR2 促进的脉冲蓝光激勉期间单个神经元的分辨率取决于光敏细胞的密度。在使用 hSyn 或 CaMKIIα 启动子驱动 mPFC 抒发而产生的 ChR2 抒发细胞的密集群体中，对脉冲刺激的一致群体反应平常会压倒单个单元的反应（图 2h 和 and3c）。关联词，好多单元仍然保执了高簇质地，同期阐发出与刺激脉冲的高度相关性（图 2i-k 和 3d-f）。比较之下，在对包含密度裁汰的 ChR2 抒发细胞的局部汇集进行光刺激时，簇质地和分离单个单元的才智不受影响，就像抒发小白卵白的神经元一样（图 3i），这是光遗传学履行的典型成就。在这种成就下，optetrode 比电刺激期间的记载具有明显的上风，电伪影收尾了分辨率，况兼不行能进行细胞类型特异性刺激。
咱们在 30 秒刺激时期对 130 Hz 刺激的电生理反应的动态变化（图 2f、g 和 3a、b 和补充图 7）的不雅察不仅进步了咱们对使用这些频率的 DBS 政策的贯通（尽管紧要的是要提神 DBS 电极可能召募与光遗传学刺激不同的轴突和细胞体模式）， 但也强调了电生理记载在光遗传学行动履行中的紧要性，因为由于电伪影，在使用电 DBS 时尤其难以科罚对局部电路的影响。除了在局部胞体的光遗传学刺激经由中提供对汇集行径的视力外，optetrode 还可用于提供受特定投射刺激影响的神经行径的读数（图 5）。临了，由于其适中的分量和占大地积（植入部位为 0.12 mm2，颅骨名义为 8 mm2），optetrode 不错与其他刺激源（如光纤）或出奇的记载电极相迎阿，为日益丰富的神经回路筹商器具箱作念出孝敬。
由于 optetrode 不错很容易地以低老本（x3C$100）制造，无需故意的开辟和最少的培训（补充阐述和补充图 9），况兼在行动履行期间提供高质地的电生理记载，因此用 optetrode 植入的动物老例补充转导的动物队伍变得很浅近，这些动物可用于在光遗传学驱动行动期间监测单元。这种方法将促进行动数据的分析，减少与不雅察到的（而不是假定的）局部单元行径一致的解释数目，从而最大限定地减幼年鼠行动分析中的偏见和骄贵吹法螺。通过提供与光遗传学的速率和特异性兼容的快速多通谈读数，Optetrode 向进一步开发系统神经科学的精准和因果电路筹商迈出了一步。
3.1 Optetrode 制造
咱们将 16 根团员物涂层的 NiCr 微线聚首到电极接口板和金针并将它们缠绕成四个四极敛迹。然后将这些束穿过保护性塑料管（16 毫米长，0.02 英寸内径，0.002 英寸壁厚;小零件），用 Loctite 环氧树脂聚首到 EIB。机械传动安装的塑料外壳是在 SolidWorks 2007中筹备的，并在里面加工。不锈钢拇指螺母通过两个塑料干预销固定在外壳上。不锈钢透风螺钉的下半部分从两侧减薄，产生 0.0625 英寸× 0.086 英寸的横截面（原始螺钉直径为 0.086 英寸），这导致过盈和解（摩擦和解）到塑料外壳的导向通谈（0.23 英寸长，0.063 英寸× 0.09 英寸横截面）。然后将透风螺钉拧入拇指螺母中，并通过逆时针动弹拇指螺母来裁汰，使螺钉的薄部分位于导向通谈中，从而驻扎螺钉在前进经由中旋转。然后将带有聚首管和四极敛迹的 EIB 与机械驱动器拼装在一齐，使 EIB 与透风的螺帽王人平，况兼包含四极管的保护管位于螺杆的透风口内。一个光纤插芯（200 μm 硅芯光纤，不锈钢插芯，5 mm 高，2.5 或 1.直径为 25 mm，多立克透镜）然后添加到组件中，以便光纤与四极敛迹分享保护塑料管的里面，并将套圈成就在 EIB 的顶部以便于造访。光纤套圈和 EIB 用 Loctite 环氧树脂聚首到透风螺钉上。将四极管切割成所需的长度（在光纤下方蔓延 ~0.5 mm）。胶体金通过电化学千里积到微线的责任端（驱动电流 ~50 mA）。此经由将微线的阻抗从 3-10 MΩ 裁汰到 150-350 kΩ（责任阻抗）。然后，EIB 的顶部粉饰有 Loctite 环氧树脂保护层，以保护脆弱的微线在手术和动物行动经由中免受潜在损坏（参见补充阐述）。
3.2 科目
通盘履行均字据斯坦福机构动物照顾和使用委员会批准的决策进行，并取舍一切防御步调以尽量减少压力和所用动物的数目。咱们使用了病毒打针时 8 周龄的雄性小鼠。
3.3 病毒打针和 optetrode 植脱手术
执政生型小鼠的 hSyn 或 CaMKIIα 启动子的限定下，使用 AAV5 将 ChR2-EYFP 和 eNpHR3.0-EYFP 的遗传物资寄递到小鼠神经元，或使用带有 EF1α 启动子的 DIO 构建体13 在 PV：：Cre （S. Arber， University of Basel） 转基因小鼠中。AAV5 病毒由北卡罗来纳大学教堂山分校 （University of North Carolina） 教堂山分校 （University of North Carolina） 教堂山分校 （University of North Carolina） 的 Vector Core 坐蓐，滴度为 3.0 × 1012 cfu ml-1。通盘小鼠均通过腹膜内打针氯胺酮-甲苯噻嗪搀杂物麻醉，然后放入立体定向框架 （David Kopf Instruments）;然后提供低剂量的异氟醚以在手术经由中保执深度麻醉景况。将病毒从三个深度（距前囟 1.6-1.8 mm、2.4-2.5 mm 和 3-3.3 mm）打针到 mPFC 中。每个打针部位的总病毒体积为 300 nl，打针速率为 150 nl min-1。然后将 Optetrode 放入开颅手术中，直到四极管到达距离前囟 1.2-1.6 mm 的深度。在使用 Metabond （Parkell） 将 optetrode 永恒附着到颅骨上之前，四极管用凡士林层和 Kwik-Kast 有机硅弹性体保护。植入后，用 Vetbond 粘合剂 （3M） 将 optetrode 周围的皮肤粘合在一齐;皮下打针 Buprenex （0.05 mg/kg 体重） 和 Carprofen （5 mg/kg） 用于规复期间的凄惨治理。
3.4 免疫组化和影像学检讨
小鼠用 Beuthanasia-D麻醉，并在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） （pH 7.4） 顶用冰冷的 4% 多聚甲醛 （wt/vol） 全心灌输。将大脑在 4% 多聚甲醛中固定过夜，并在 PBS 中的 30% 蔗糖 （wt/vol） 中均衡。咱们在冷冻切片机（徕卡）上切下 40 μm 冠状切片，并将它们储存在 4°C 的冷冻保护剂（25% 甘油（体积/体积），30% 乙二醇（体积/体积），在 PBS 中），直到咱们处理它们进行免疫组织化学。将目田飘浮的切片在 PBS 中洗涤，然后在 0.1% Triton X-100 （vol/vol） 和 3% 正常驴血清 （vol/vol） 中孵育 30 分钟。将切片与 3% 正常驴血清中的一抗（小鼠 CaMKIIα 抗体，1：500，Abcam;兔小清卵白抗体，1：500，Abcam;兔抗 GABA 抗体，1：500）。然后用PBS洗涤切片，并在20°C下与二抗（与Cy3或Cy5偶联的驴抗体，以及与Cy3或Cy5偶联的兔驴抗体，均以1：1,000）孵育3小时。然后用 PBS 洗涤切片，用 DAPI （1：50,000） 孵育 20 分钟，再次用 PBS 洗涤，并用 PVA-Dabco封固在载玻片上。在扫描激显豁微镜 （Leica SP5） 上使用 40×、1.25 NA 油浸物镜汇集共聚焦荧光图像。图像不受数字对比度或亮度调度的影响。
一组 5 只小鼠（2 只 CaMKIIα：：ChR2、1 只 CaMKIIα：：EYFP 和 2 只 PV：：Cre）显露于八个 100 mW mm-2 蓝光刺激时期（每个 30 秒）和 5 ms 脉冲宽度的蓝光下，对可能的和直率组织毁伤进行了处理;大脑被固定、切片、DAPI 染色并仔细检讨。尽管这种蓝光处理（若是有的话）比图中提供光遗传学刺激的情况更严重，但咱们仍然莫得不雅察到纤维下方或周边组织中组织质地（变形、DAPI染色或着色更正、细胞数目、核大小或款式变化）的各异。关联词，这是在通盘光遗传学履行经由中需要追踪和检讨的紧要参数。
3.5 数据汇集和分析
通盘电生理记载均使用 Digital Lynx 10S-Z800 集成硬件和软件系统 在澄澈、目田迁移的动物中进行。电信号经过过滤 （600–6,000 Hz） 并使用 HS-18-CNR-LED 头级放大器进行放大。使用神经数据汇集软件中集成的 LED 追踪系统追踪 40 × 40 厘米浅灰色野外内的鼠标位置。纤维和四极管在履行前至少 30 分钟通过机械驱动器传播到记载点（平常扬弃过夜），以确保褂讪的记载。通过通过氧化锆套管 （Doric Lenses） 聚首到光学套管 （Doric Lenses） 的光纤套圈的套圈端接植入式光纤 （Doric Lenses） 进行光刺激。为了对抒发 ChR2 的小鼠的 mPFC 进行光学刺激，咱们使用了蓝色二极管泵浦固体激光器（λ = 473 nm，OEM 激光器），脉冲频率为 5 Hz、20 Hz 或 130 Hz，脉冲宽度为 5 ms（或在某些情况下为 130 Hz，脉冲宽度为 2 ms），光纤顶端的功率密度为 60-160 mW mm-2（功率输出是通过非植入式光纤插芯测量的，该光纤插芯与用于 Optetrode 的阿谁）。从光纤顶端不同距离处的光功率被揣摸为波长和光纤顶端光功率的函数（参考文件 30 的计较已针对波前途行阅兵）。
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关于在 hSyn 启动子下抒发 ChR2 的小鼠，OFT 期间的刺激包括每 2 分钟起初的 30 秒刺激时期。epochs 期间的刺激频率使用 5 ms 脉冲宽度通过 5 Hz、20 Hz 或 130 Hz 刺激序列轮回两次。在 CaMKIIα 启动子限定下抒发 ChR2 的小鼠和在抒发小白卵白的神经元中抒发 ChR2 的小鼠，以及仅抒发 EYFP 的对照小鼠中，刺激频率的划定被胪列以限定序列特异性效应。在 OFT 经由中，每种刺激类型都恰好运用了两次。为了对抒发 eNpHR3.0 的小鼠的 mPFC 进行光学刺激，咱们使用了连气儿波模式的绿色二极管泵浦固态激光器（λ = 561 nm，CrystaLaser），功率密度为 160-260 mW mm-2 在光纤顶端。30 秒刺激时期与 90 秒的休息时期分开，并在履行经由中叠加 7-8 次。
使用 OfflineSorter 2.8.9.0 （Plexon） 手动对神经数据进行排序，并在 MATLAB中进行分析。针对 Digital Lynx 检测到的每个尖峰事件，索求四个四极管通谈上的最大和最小电压。尖峰事件蚁集在这个八维特征空间中。与噪声簇（最围聚原点的尖峰簇）不同的尖峰簇是在一个或多个二维投影中使用多边形界说的。集群被界说为对尖峰区间 （ISI） 分散不行见。唯有包含 <0.01% 的 ISI < 1 ms 尖峰的集群才被推敲作为单个单元的候选者进行进一步检讨。然后使用两个定量目的评估每个集群的质地：L 比值和进犯距离30。
此项政策，指的是一线教师教学满30年，且仍从事一线教学工作，同时受聘一级教师职称岗位满10年，且满足高级教师基本条件的，可以直接认定高级教师。并且通过比例为100%，不占单位岗位核定职数。
这些测度计较簇中的尖峰与合并四极管上记载的其他尖峰的分离进度。L 比率将聚类视为多变量高斯分散，并线路非聚类尖峰来自该高斯分散的平均概率。训导标明，它绝顶能指令 II 类舛讹或遗漏尖峰的数目。进犯距离揣摸了簇尖峰与合并四极管上记载的其他尖峰的距离，并已被阐述标明 I 类舛讹或混浊尖峰的数目。当集群中的峰值多于集群中的峰值时，进犯距离是不敬佩的。在这些旷费的情况下，仅使用 L 比值来评估集群质地。在八维特征空间中 L 比小于 0.2 且进犯距离大于 15 的集群被以为是推定的单个单元。由于集群质地目的仅在使用疏导数目的维度进行计较时具有可比性，因此排斥了一个或多个电极断开的四极管。集群也作为时辰的函数进行了检讨。在高频刺激期间，不错不雅察到一些簇平滑地向较低振幅的尖峰迁移。在这些情况下，若是该群集仍可与其他尖峰离别开来，则将多边形界说为包含涂抹的群集。在图 3h 中，两个神经元在光刺激期间莫得尖峰，因此具有未界说的簇质地评分。这些神经元在光刺激期间莫得被看成分离风雅。
关于某些分析，使用了多单元辐射速率。计较每个四极管的多单元辐射速率为图 2af 的 1 秒区间中通盘阈值交叉的速率，图 2g 和 3b、3b 的 3a、g、100 毫秒区间中的通盘阈值交叉率，以及图 4 的通盘纪元。多单元辐射速率取孤立记载数目（OFT 履行的数目乘以履行期间记载电压阈值交叉的四极管数目）的平均值。图 2a、f 和 3a、b 中的暗影区域以及图 4c 中的条形自大了这些描摹集成平均 MUA 的平均值的程序过失。
关于抒发 eNpHR3.0 的小鼠的数据分析，若是神经元在光刺激期间的放电速率的 z 分数相关于布景放电速率为 <−1.3，则将其归类为禁绝神经元（图 2c-e）;z 评分> 1.3 的神经元被归类为增强神经元（图 2e）。为了计较 z 分数，咱们将预刺激时期和光刺激时期的放电率分红 10 秒的区间，并比较速率的效果分散。
为了评估蓝光 （λ = 473 nm） 刺激对在小白卵白阳性神经元（和 EYFP 对照）中抒发 ChR2 的小鼠神经元放电率的影响，咱们比较了光脉冲前 20 毫秒的平均放电与 20 Hz 刺激期间光脉冲后 10 毫秒的平均放电。使用非参数自助评估每个神经元放电速率变化的显贵性：使用赶紧脉冲时辰进行 1,000 次模拟。
在 MATLAB 中对位置数据进行统计分析。清明状貌的中心被界说为距离通盘四面墙大于 10 厘米。位置用 0.6 s 箱式滤波器平滑以去除噪声。使用随后 25 个视频帧 （~0.84 s） 中行进的距离揣摸每个时辰点的速率。在图 4 中，P 值是通过 Bonferroni 阅兵的双尾学生 t 磨砺计较的。
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